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文献解读 | 环状RNA位点的缺失可导致miRNA异常并影响大脑功能
科技服务 2015-11-26

文章来源:

发表在“Science”,影响因子37.205


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背景介绍

CircRNAs (Circular RNAs,环形RNA分子) 是一类不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。CircRNA是近年来RNA领域最新的研究热点,它是前体RNA (pre-mRNA) 通过一种叫做反向剪接反应 (back-splicing) 的特殊选择性剪接产生,在真核细胞中广泛表达的环形内源性RNA分子。尽管被低效地加工,大多数呈低水平表达,但研究发现一些circRNAs源自与人类疾病相关的基因组位点,而且有越来越多的证据表明它们在转录、转录后及翻译调控中的潜在作用。

成百上千的环状RNA在哺乳动物的大脑中富集,通常表现为保守的表达。Cdr1as是一种在哺乳动物大脑中大量表达的环状RNA,也是目前研究的最多的几种环状RNA之一,它可以作为miRNA的“吸收棉”,因为它有超过60个miRNA miR-7的结合位点,不过其具体作用依然不清楚。

Cdr1as,这种特定的circRNA能够在兴奋性神经元中发现但不在神经胶质细胞中发现。在小鼠和人类的大脑组织中,存在两种结合到它上的microRNA:miR-7和miR-671。Cdr1as参与多种生物学过程,如:细胞凋亡、剪接过程、神经形成。


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解读专栏

作者首先通过CLIP-Seq对miR-7嵌合体中的靶序列进行分析和排序,在小鼠和人大脑中,排在第一位的都是Cdr1as,与miR-7结合的RNA中排在第二位的是lncRNA Cyrano。能与Cdr1as结合的还有miR-671,但miR-7和miR-671跟Cdr1as的结合方式差异很大,Cdr1as有70个miR-7 结合位点,而只有一个很强的miR-671结合位点。通过RNA-FISH对不同的神经细胞用不同的荧光标签进行区分,发现在皮质切片中Cdr1as只在神经元中表现出高表达,而且主要集中在兴奋性神经元中,而在神经胶质细胞(少突胶质细胞和星形胶质细胞)中不表达。图D展示的是利用CRISPR/Cas9敲除Cdr1as基因座,后续分别通过基因型、原位杂交、Northern blot和qRT-PCR验证。


本文选取了高表达Cdr1as的小脑、皮质、海马和嗅球等4个主要脑区进行miRNA seq。比较WT和KO小鼠4个脑区中的miRNAseq数据,并结合Northern blot,发现miR-7在KO小鼠中显著下调。更加具体的情况是,miR-7a-5p和miR-7b-5p(它们的来源序列相同,成熟的RNA序列略有差别)在所有的脑区中均下调。与miR-7相反,在KO动物的小脑、皮质和嗅球中,miR-671-5p 表达上调。


如下图所示,通过Northern blot、荧光原位杂交等方法进行验证,miR-7在KO小鼠中表达显著下调。


在上面4个脑区中检测miRNA的同时做mRNA-seq。在皮质、小脑和嗅球中,一些保守的miR-7靶基因显著上调,包括Fos、Nr4a3、Irs2、Klf4。此外,可与miR-7相互作用的lncRNA Cyrano在KO小鼠的4个脑区中都高表达。进一步对这些上调的基因进行审查,发现了一些显著的IEGs,比如Fos、Arc、Egr1、Egr2、Nr4a3 等。用同一只动物和另外的动物中的皮质和海马,通过qRT-PCR和Nanostring进行验证,确认了所有的候选基因中,即早基因的蛋白表达水平升高。其中c-Fos、Egr1、Arc等通过Western Blot检测,进一步通过免疫组织化学方法验证c-Fos和Egr1在大脑切片中的表达。在四个脑区中对c-Fos的免疫组化结构进行定量,发现在KO小鼠中,表达c-Fos的神经元的数量增多,而且c-Fos信号强度更强。




利用单海马神经元研究兴奋性突触后电流 (excitatory post synapticcurrents, EPSCs)。结果发现,在KO小鼠的神经元中,自发性的囊泡释放显著上调,微小兴奋性突触后电流频率(而不是振幅)加倍。通过分析钙离子诱发的突触反应,发现KO与WT小鼠神经元相比,兴奋性突触后电流的振幅并没有显著不同。虽然计算得到的囊泡释放概论没有发生显著改变,但是KO小鼠对两个连续刺激的响应,以及对10Hz的动作电位序列的响应与WT小鼠显著不同。

小鼠行为上有什么具体体现呢?分别对WT小鼠和KO小鼠进行行为学实验KO小鼠的社会活动、焦虑水平、不受干扰的自发活动、在认知记忆或探索行为方面都没有显著的缺陷,但是唯独惊吓反应测试中,在三个不同的前脉冲强度下,前脉冲抑制 (prepulse inhibition,PPI) 显示出很强的差异。


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研究结论及意义

1.Cdr1as主要在神经元中表达,几乎不在胶质细胞中表达;

2.Cdr1as-KO小鼠大脑中miR-7显著下调,miR-671显著上调,其它组织中miR-7和miR-671表达变化不明显;

3.Cdr1as的敲除显示出与神经精神疾病相关的表型,比如PPI受损,而且IEGs很有可能参与其中。这些结果为今后的研究提供了很好的参考价值,也提供了很多可供挖掘的线索。


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